提供商：	广州华银医学检验中心有限公司
服务名称：	单细胞转录组测序
规格：	/sample

       单细胞转录组测序是指对单个细胞进行转录组测序，并对获得的数据进行生物信息学分析。单细胞转录组测序主要用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表达谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因分析。       转录组测序是利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，能够全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，进行疾病与正常样本间的基因表达差异分析、可变剪切和融合基因分析，寻找与癌症、遗传病相关的致病基因，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。相对于传统芯片而言，无需预先设计特异性探针，具有分辨率高、检测范围广和准确率高的优点。1、实验方案     测序策略：Illumina NextSeq 500或 HiSeq 3000  PE150     数据量：推荐8G clean data2、技术优势（1）精准分选：先进分离技术，真正的单细胞测序（2）高灵敏度：领先的微量核酸扩增技术, 全面检测低至单个细胞的基因信息（3）扩增均一：采用SoLo扩增技术，cDNA合成效率高，无扩增偏好3、信息分析3.1 标准信息分析（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；（2）与参考序列比对，计算不同基因的RPKM值；（3）基因的差异表达分析；（4）样本间基因表达水平的相关性分析（仅限于有生物重复的样本）；       （5）样本间差异基因韦恩图及PCA分析；（6）差异基因的表达模式聚类分析；（7）差异表达基因GO功能富集分析；（8）差异表达基因Pathway显著富集分析；（9）差异表达基因的蛋白质互作网络分析；（10）条件特异表达；（11）鉴定基因的可变剪切；（12）SNP/InDel 分析；（13）新转录本预测及注释；（14）融合基因分析（仅限于人）。3.2 高级信息分析（1）基因结构优化（只针对真核生物）；（2）RNA编辑；（3）差异基因的转录因子分析（适用于植物）。4、技术流程 5、案例分析       案例（1）单细胞转录组测序识别胚胎发育的关键因素       已分化的体细胞可以通过细胞核转入刺激再分化成为全能性胚胎体。然而，大部分克隆胚胎在早期就停止发育了，同时其潜在的分子机制原理等还未被探索突破。本研究通过获得体细胞核移植的胚胎，并将其培育到2或4个细胞的时期，在活检系统中对细胞的发育与分化等进行追踪了解。然后，通过单细胞转录组测序的方法对不同分化方向的细胞进行转录组测序，最后发现组蛋白去甲基化酶Kdm4b的失活会阻碍两细胞期克隆胚胎的发育。此外，还发现另一个组蛋白脱甲基酶Kdm5b的失活是四细胞期胚胎停育的原因。以克隆小鼠为模型，重新注入Kdm4b和Kdm5b可以恢复细胞核移植胚胎的转录同时促进囊胚发育（超过95%）。 图1 四细胞状态体细胞核移植胚胎与Kdm5b表达的关系 图2 Kdm4b和Kdm5b注入与体细胞核移植胚胎发育的关系       案例（2）单细胞转录组测序在原发性乳腺癌检测中的利用       在这项研究中，来自韩国的研究人员分析了11名患者的515个细胞的转录组。这些患者有四种不同的乳腺癌亚型：luminal A、luminal B、HER2和三阴乳腺癌。研究人员利用Fluidigm的C1单细胞全自动制备系统来制备单细胞，并在Illumina的HiSeq 2500系统上开展全外显子组和转录组测序。他们从单细胞RNA-Seq数据中推断出拷贝数变异（CNV），帮助确定不同的癌症群体。比如，研究人员发现三阴乳腺癌细胞表达更具侵袭性的癌症特征，如参与上皮-间质转化和血管生成的基因等。图1 单细胞分辨率的亚型特异性基因表达谱参考文献[1] Liu et al. Identification of key factors conquering developmental arrest of somatic cell cloned embryos by combining embryo biopsy and single-cell sequencing. Cell Discovery, 2016.[2] Chung et al. Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary breast cancer. Nature Communications, 2017.